Ovociti umani in provetta pronti per la fecondazione

Un team di ricercatori scozzesi e Americani pare sia riuscito a sviluppare degli ovociti umani a partire da precursori Immaturi E si tratterebbe di un risultato che potrebbe in qualche modo aiutare le ragazze prepuberi trattate per un tumore a diventare madri una volta che viene archiviata la malattia insieme a chemio e radioterapia. Il risultato si è ottenuto Nei laboratori di Evelyn Telfer ricercatrice dell’Istituto of cell biology dell’università di Edimburgo e si tratta di un risultato di quelli che gli addetti ai lavori hanno definito ‘breaktrhough’, ovvero un punto di svolta una rivoluzione proprio nella storia della medicina riproduttiva. Il gruppo di ricercatori dell’università di Edimburgo insieme ai colleghi del Centre for Human Reproduction di New York, sembra sia riuscito a convincere degli ovociti umani Immaturi a svilupparsi completamente in laboratorio ed a raggiungere lo stadio maturo in soli 22 giorni.

L’organismo generalmente ci impiega 5 mesi per poter raggiungere lo stesso risultato e quindi questo fa capire che si tratta di un risultato davvero straordinario. Più che altro, si tratta di un esperimento fatto in laboratorio Ma che ha delle potenzialità davvero straordinarie e di applicazione in clinica ancora però tutte da verificare. Manca Al momento la dimostrazione che questi ovociti che sono maturati in modo artificiale, abbiano la capacità, una volta Uniti ad Uno spermatozoo, di dare vita ad un embrione sano da impiantare in una donna con problemi di fertilità.

Le candidate ad utilizzare questa innovativa tecnica sono le donne che sono state trattate per qualche forma di tumore con agenti chemioterapici che hanno danneggiato gli ovociti precludendo loro la possibilità di potere diventare madre in seguito alla malattia. Sono tante In effetti le donne che ricorrono al congelamento degli ovociti prima di sottoporsi alla chemioterapia Ma quando la paziente è una ragazzina con delle cellule uovo immature, nelle quali viene prelevato un pezzetto di tessuto ovarico E poi viene impiantato una volta che viene archiviata la malattia. Ad oggi vengono prelevati e congelati gli ovociti, i quali saranno poi utilizzati successivamente con delle tecniche di procreazione assistita Oppure si preleva un pezzetto di tessuto ovarico soprattutto Nelle pazienti più giovani o quando non c’è il tempo di poter stimolare le donne per produrre gli ovociti e questo viene congelato e reimpiantato dopo le terapie ovvero Quando una donna è guarita.

Però per poter essere impiantato serve un intervento chirurgico e quindi si tratta di una procedura invasiva e inoltre Come già abbiamo riferito non sempre l’ovocita torna a funzionare e non si elimina del tutto il rischio che il tessuto reimpiantato possa reintrodurre il cancro nella paziente. Qualora invece non si decida di impiantare l’intero tessuto ma si preleva qualche ovocita da far crescere in vitro il rischio cancro Cala drasticamente.

Ogni anno in Italia da 20.000 a 30.000 nuove coppie richiedono una consulenza specialistica perchè presentano difficoltà ad ottenere una gravidanza. Si stima che in 15.000 – 20.000 di queste coppie ( dati ISTAT) sarà possibile diagnosticare una causa nota di infertilità e sarà, perciò, necessario ricorrere alle terapie mediche disponibili per agevolare o consentire il concepimento. Per fertilità si intende comunemente la condizione in cui la coppia, dopo due anni di tentativi di concepimento, non consegue la gravidanza. Il termine “sterilità” rimane invece riservato ai casi in cui sia accertata l’impossibilità assoluta al concepimento.

Negli ultimi anni, grazie allo sviluppo della tecnologia riproduttiva, sono sempre più rari i casi di sterilità irreversibile e, dopo uno studio accurato della coppia infertile è possibile esprimere un parere circa la tecnica più opportuna in quel caso e quali saranno le possibilità di successo per quella coppia in particolare. A questo proposito è bene ricordare che la specie umana è in assoluto poco fertile rispetto alla maggior parte degli altri mammiferi. Una coppia giovane, sicuramente fertile e con regolare attività sessuale, non ha più del 20/25% di possibilità di concepire per ogni ciclo ovulatorio. Le tecniche di fecondazione assistita spesso consentono alle coppie infertili di avvicinarsi o raggiungere le percentuali fisiologiche ( normali in natura) di gravidanza per ciclo delle coppie fertili. Va anche tenuto conto del fatto che la fertilità della donna è massima intorno ai 20-25 anni, mentre decresce gradualmente fino alla menopausa con un calo consistente già dopo i 36 anni. Concludendo, possiamo affermare che per molte condizioni di infertilità che fino a pochi anni fa si prospettavano senza soluzione, possiamo oggi proporre tecniche di PMA ( procreazione medicalmente assistita) che presentano percentuali di successo ben precise, legate sia a limiti intrinseci alla procedura, sia alle caratteristiche specifiche della singola coppia infertile. Queste percentuali, che possono apparire basse rispetto all’impegno fisico, psicologico, emotivo, medico ed economico che comportano, vanno considerate tuttavia soddisfacenti qualora le si rapporti al potenziale di fertilità spontaneo di quella coppia.

IL BAMBINO NON ARRIVA: QUANDO RIVOLGERSI ALLO SPECIALISTA Come si è già visto, la fertilità della specie umana non è molto elevata: si calcola che una coppia sicuramente fertile con una regolare attività sessuale dopo due anni di tentativi abbia usufruito solo dell’80% delle proprie possibilità di concepire. Per questa ragione si dice abitualmente che due anni sono il periodo di tempo da concedere alla coppia per tentare di ottenere spontaneamente la gravidanza prima di potere ipotizzare una condizione di subfertilità o di infertilità e cominciare quindi un adeguato iter diagnostico e di impostare una strategia terapeutica. Occorre valutare l’età della coppia. Se la coppia ha un’età relativamente avanzata, cioè se l’età della donna supera i 34-35 anni è bene non perdere tempo, almeno nell’iniziare alcuni accertamenti preliminari. Può essere quindi opportuno rivolgersi ad uno specialista di problemi riproduttivi già allo scadere del primo anno di ricerca infruttuosa di gravidanza. Se l’età della paziente è più avanzata, è bene ricorrere ad una consulenza ancora prima ( dopo 6 mesi di tentativi) Fondamentale non perdere tempo qualora nella storia clinica di uno dei partner esistano elementi che possano far temere una riduzione del potenziale di fertilità come, ad esempio, una storia di ripetute infiammazioni pelviche o di interventi addominali che possano aver determinato patologie aderenziali dell’apparato femminile.

Altro elemento fondamentale è il tempo di esposizione al rischio di gravidanza: se la ricerca attiva data solo un anno, ma negli anni precedenti non si era utilizzata alcuna pratica contraccettiva, è verosimile che il potenziale riproduttivo della coppia non sia particolarmente elevato. Anche in questo caso è consigliabile non attendere troppo per un consulto medico. Perchè sia possibile ottenere una gravidanza spontanea sono indispensabili alcuni requisiti minimi, quali un’attività ovulatoria più o meno regolare, una normale funzionalità tubarica e parametri seminali accettabili. Nonostante i numerosi mezzi diagnostici disponibili, per una significativa quota di coppie non è possibile riscontrare alcuna causa nota responsabile del mancato concepimento. Per tali pazienti si ricorre al termine di “ infertilità inspiegata o idiomatica”: in queste coppie le possibilità diagnostiche a disposizione al momento, non consentono di individuare una causa della loro difficoltà. Le possibili cause di sterilità e la loro incidenza possono essere così descritte: Sterilità maschile 35% Sterilità femminile meccanica 35% Sterilità femminile ormonale 15% Sterilità di coppia 5% Sterilità idiopatica ( inspiegata) 10% La messa a punto di un iter diagnostico adeguato alle caratteristiche della coppia, all’età dei partner, alla storia clinica di entrambe e al tempo già trascorso alla ricerca di una gravidanza, è compito specifico dello specialista in medicina della riproduzione, evitando esami inutili ed altrettanto inutili perdite di tempo.

Lo specialista individuerà il corretto iter diagnostico-terapeutico procedendo secondo un gradiente crescente di complessità ed invasività, senza mai dimenticare il fattore tempo, le caratteristiche della coppia e con la consapevolezza che dall’eventuale fallimento delle prime tecniche proposte si ricaveranno indicazioni per le proposte successive. Strategie terapeutiche Non tutte le condizioni di infertilità di coppia richiedono trattamenti di fecondazione assistita. Molte possono essere affrontate con terapie mediche o chirurgiche tradizionali. Induzione dell’ 0vulazione Causa frequente di sterilità femminile è la patologia dell’ovulazione. Il meccanismo dell’ovulazione è complesso e coinvolge strutture cerebrali ( ipotalamo ed ipofisi) e periferiche (ovaio). I disturbi dell’ovulazione possono risiedere a livelli diversi, che prevedono differenti approcci terapeutici (alcuni casi possono essere risolti riportando semplicemente la paziente al suo peso forma). Solitamente il problema ovulatorio può essere affrontato e risolto con l’aiuto della terapia medica, che può correggere eventuali situazioni patologiche che interferiscono negativamente con i meccanismi ovulatori ( esempio: iperprolattinemia), sia stimolando direttamente l’attività ovarica con l’induzione farmacologica dell’ovulazione. Tra i farmaci in grado di indurre l’ovulazione sono contemplati: il citrato di clomifene (e simili): questi farmaci stimolano le strutture cerebrali coinvolte nel meccanismo dell’ovulazione, spingendoli a migliorare il segnale che trasmettono alle ovaia stesse. Quindi questi farmaci “migliorano la comunicazione” tra le singole strutture interessate nell’ovulazione.

Le gonadotropine: si tratta di ormoni prodotti fisiologicamente ( cioè “ normalmente”) dall’ipofisi per stimolare la funzionalità dell’ovaio. Possono essere estratte da materiali biologici umani ( quindi di origine estrattiva) oppure essere sintetizzate in laboratorio, con il vantaggio che in ogni confezione è presente costantemente la stessa quantità di ormone e di maggior purezza. Le gonadotropine ( sia estrattive che sintetiche) sono altamente efficaci e vengono ampiamente utilizzati da anni per indurre l’ovulazione in casi di disfunzione, sia, utilizzando dosi maggiori, per ottenere lo sviluppo contemporaneo di più follicoli ( induzione multipla dell’ovulazione). Questa è necessaria in molte tecniche di Riproduzione Assistita. Il GnRH: è l’ormone ipotalamico che stimola fisiologicamente stimola l’ipofisi. Si utilizza quando il disturbo dell’ovulazione si localizza a questo livello. Si somministra mediante infusione sottocutanea o endovenosa regolata da pompe temporizzate a frequenza programmata ( GnRH pulsatile). 5 Infertilità da anomalie della cavità uterina o delle tube Malformazioni uterine ( utero setto, bicorne) o acquisite ( polipi, fibromi, aderenze) della cavità uterina possono ostacolare, più che il concepimento, la normale evoluzione della gravidanza, provocando aborti più o meno precoci.

Le anomalie della morfologia, della pervietà ( apertura) e decorso delle tube sono in genere acquisite e conseguenti ad infiammazioni ed infezioni, endometriosi, precedenti ostetrici (gravidanze extrauterine). Le forme congenite sono per lo più associate a malformazioni che interessano anche l’utero. Quando è possibile, le anomalie morfologiche dell’utero vengono corrette per via endoscopica ( cioè senza “ tagliare” l’addome). Qualora il trattamento chirurgico ( sia laparoscopico che tradizionale) non sia in grado di correggere le alterazioni della morfologia e del decorso tubarico ( sterilità meccanica), si ricorre a tecniche di Riproduzione Assistita. Endometriosi Si tratta di presenza di tessuto di rivestimento interno dell’utero ( mucosa endometriale) al di fuori della cavità uterina. Questo tessuto risponde alle variazioni ormonali dell’attività ovarica e quindi risponde con la proliferazione e la successiva desquamazione dando una sorta di mestruazione ma in sedi anomale: si ha cioè un “ sanguinamento” in sedi anomale ( ovaio, intestino, tube, vescica). Questa sorta di mestruazione interna determina infiammazione, dolore che aumenta durante il flusso mestruale e formazione di aderenze tra gli organi vicini. L’endometriosi è quindi una causa indiscutibile di ipofertilità o sterilità. Le terapie possono essere di tipo medico e si basano sulla soppressione dell’attività ovarica.

In presenza di formazioni cistiche ( “cisti cioccolato”) dell’ovaio è consigliabile l’approccio chirurgico e particolarmente la via endoscopica ( senza tagliare l’addome), in grado di risolvere anche i casi di sindrome aderenziale, concorrendo a favorire l’insorgenza di una gravidanza. Subfertilità maschile Quando la valutazione andrologica ha consentito l’identificazione del fattore alla base delle alterazioni dei parametri seminali, è possibile programmare un’adeguata terapia medica o, secondo i casi, chirurgica. Nella valutazione andrologica l’esame del liquido seminale consente di mettere in luce l’eventuale presenza o meno di un problema, che poi dovrà essere chiarito in modo acconcio. Ricordiamo che, perchè lo spermiogramma ( esame del liquido seminale) sia attendibile, occorre che il materiale venga prodotto per masturbazione, direttamente in contenitore sterile, dopo accurata detersione dei genitali e dopo una astinenza ( assenza di eiaculazioni) non inferiore a 3 giorni e non superiore a 7. Il seme andrà raccolto direttamente presso il laboratorio che lo esaminerà. Fatta diagnosi e impostate tutte le terapie ritenute opportune dall’andrologo, se il seme non potrà essere comunque considerato valido per una fecondazione naturale, si potrà allora ricorrere a tecniche di fecondazione assistita. 6 Le tecniche di riproduzione assistita Si tratta di tecniche di acquisizione relativamente recente, frutto di anni di ricerca di numerosi medici e biologi.

La prima bambina concepita “in provetta” nacque nel 1978. La tecnica prevedeva una fertilizzazione “ in vitro” ed il successivo trasferimento in utero dell’embrione così concepito ( Fertilizzazione ‘in vitro’ ed Embryo Trasfer) Da questa sono derivate, nel corso dei decenni successivi, altre varianti che vedremo. Le tecniche di riproduzione assistita sono differenziate in base alla loro invasività ( cioè coinvolgimento fisico e psichico dei pazienti): abbiamo tecniche maggiori e minori. 1. Le tecniche minori Inseminazione intracervicale Il seme, raccolto per masturbazione, viene posto in termostato per 30′ ( dove subisce la stessa trasformazione che si svolge in vagina dopo il rapporto sessuale) ed immesso nella cervice uterina ( primo tratto dell’utero). Questa tecnica viene utilizzata nei casi di disfunzione coitale ( difficoltà al rapporto sessuale) e si affida, in tutte le sue fasi successive, alla fertilità spontanea della coppia. Inseminazione intrauterina( IUI) e Intraperitoneale ( IPI) In queste tecniche il liquido seminale viene preparato secondo un trattamento detto di “ capacitazione”, cioè un trattamento che mira a scegliere gli spematozoi dotati di migliore vitalità. Il seme preparato viene deposto dal medico a diversi livelli del tratto genitale femminile: nella cavità uterina nel caso della IUI e all’interno della cavità pelvica ( ricoperta dal peritoneo) nella IPI. L’ovulazione, in queste tecniche, può essere ottenuta nel corso di un ciclo spontaneo ( con lo sviluppo di un solo “ uovo”) oppure, più spesso, blandamente stimolato con citrato di clomifene o gonadotropine, al fine di produrre più ovociti per ogni trattamento (massimo 3 follicoli).

Lo sviluppo e la crescita follicolare vengono monitorati ( controllati) mediante ecografie pelviche effettuate in giorni successivi del ciclo ( seriate) durante la prima metà del ciclo (monitoraggio ecografico della crescita follicolare). Quando la crescita follicolare appare soddisfacente, il medico induce lo scoppio dei follicoli ( i contenitori dell’uovo), somministrando una gonadotropina particolare, la gonadotropina corionica umana (HCG) che provoca l’ovulazione ( cioè la rottura dei follicoli con l’emissione dell’ovocita maturo). Tale evento si realizza intorno alle 33-34 ore dopo la somministrazione dell’ HCG e quindi si programmerà l’inseminazione entro le 48 ore successive. Due ore prima dell’inseminazione, si richiede la produzione del liquido seminale e si procede alla preparazione di questo, selezionando, come già detto, gli spermatozoi con Figura 1 7 maggior vitalità ed eliminando batteri e detriti. Questa selezione è svolta, nei concepimenti naturali, nella cervice uterina con il fenomeno della “capacitazione”. Il seme così preparato viene caricato in un catetere ( sottile tubicino) ed introdotto nella cavità uterina ( IUI) o all’interno del peritoneo pelvico ( IPI). Esiste la possibilità, con cateteri adeguati, di deporre il seme così trattato anche all’interno della tuba ( inseminazione intratubarica – ITI) anche se tale tecnica viene poco utilizzata.

Facile comprendere come le possibilità di successo di tali tecniche (in cui sia adeguata la risposta ovulatoria ai farmaci ed il seme trattato presenti caratteristiche adeguate), dipendano fortemente dalle condizioni della cavità uterina e delle tube: occorre che almeno una di queste ultime sia aperta e ben funzionante. L’inseminazione intrauterina ( la più utilizzata delle tecniche minori per risultati ed invasività contenuta) appare perciò indicata per: °casi di modesto deficit seminale con buona risposta al trattamento di capacitazione; °sterilità da deficit dell’ovulazione dopo cicli di induzione con rapporti spontanei infruttuosi; °presenza di fattore cervicale ( ambiente cervicale ostile agli spermatozoi per cause ormonali, infiammatorie, meccaniche o immunitarie); °casi di disfunzione sessuale/ coitale in cui si abbia la difficoltà al normale svolgimento del rapporto sessuale ( impotenza, eiaculazione retrograda, vaginismo); °casi di infertilità inspiegata in cui non ci sia stato un concepimento dopo un ragionevole lasso di tempo , ma in cui l’età dei pazienti permetta un periodo di tentativi terapeutici meno impegnativi prima di affrontare metodiche più invasive ( gradualità del ricorso alle tecniche di riproduzione assistita). Le percentuali di successo non sono elevate: circa il 10-15% per ciclo ( variabile in relazione all’età della paziente). Tuttavia esse presentano il vantaggio di una scarsa invasività e quindi possono essere ripetute. Dopo 4-6 tentativi, le possibilità cumulative di successo salgono mediamente al 20-30,%, in considerazione sempre dell’età della paziente e delle caratteristiche del seme.

L’invasività della tecnica è molto bassa ed i rischi per la salute della paziente sono pressochè nulli. Nel caso dell’utilizzo di farmaci per l’induzione dell’ovulazione c’è il rischio di gravidanze gemellari. La possibilità di prevedere tale rischio è possibile nelle fasi del monitoraggio: qualora si considerasse eccessivo, è possibile non procedere all’induzione e/o all’inseminazione e sospendere il ciclo 2. Le tecniche maggiori Vengono proposte quando rappresentano l’unico trattamento possibile, o quando precedenti terapie mediche e chirurgiche, o tecniche minori di procreazione medicalmente assistita non abbiano avuto successo. Comprendono: FIV/ET ( fertilizzazione ‘in vitro’ con embryo-transfer) 8 Figura 2 GIFT ( trasferimento intratubarico di gameti) ICSI ( microiniezione intra -citoplasmatica di spematozoi all’interno degli ovociti) ZIFT, TET ( tecniche miste) MESA,TESE ( prelievo di spermatozoi dall’epididimo o dal testicolo con successiva ICSI) Zona Hatching ( micromanipolazione applicata agli embrioni) Tutte le tecniche elencate prevedono alcune tappe comuni: -induzione farmacologica dello sviluppo sincrono di più follicoli sulle ovaia, associata a monitoraggio ecografico ed ormonale della risposta ovarica, con personalizzazione della terapia in funzione della risposta ottenuta nella singola paziente -prelievo strumentale degli ovociti ( pick up) direttamente dall’ovaio, una volta raggiunte le idonee dimensioni follicolari. -preparazione con procedimenti di laboratorio di un campione di spermatozoi con le migliori caratteristiche, concentrandoli in un piccolo volume di liquido. FIV/ET Con questa tecnica si sostituisce la funzione tubarica: le prime pazienti in cui fu eseguita erano coloro che soffrivano di patologie tubariche non correggibili chirurgicamente. In seguito altre forme di sterilità ( maschile, su base immunologica, da endometriosi e idiopatica) hanno trovato soluzione grazie all’utilizzo di questa tecnica.

Stimolazione della funzione ovarica: la prima fase contempla la stimolazione della funzione ovarica in modo da ottenere una crescita multipla di follicoli. Ciò è necessario perchè ‘in vitro’ ( cioè “ in laboratorio”), ma anche nei concepimenti spontanei, le probabilità per ogni singolo ovocita di andare incontro a fertilizzazione e riuscire a svilupparsi in un feto normale, sono ridotte. La crescita follicolare multipla consente di ottenere più ovociti disponibili con un conseguente aumento complessivo delle probabilità di ottenere una gravidanza.

La stimolazione ovarica mira ad ottenere un numero adeguato di ovociti maturi da poter utilizzare nella tecnica scelta. Entro certi limiti di sicurezza, si può dire che il fine della stimolazione è ottenere il maggior numero di ovociti maturi che la paziente è in grado di produrre per singolo ciclo. La risposta ovarica alla stimolazione farmacologica è spiccatamente individuale e può variare nella stessa paziente in diversi cicli di stimolazione. In linea di massima si può grossolanamente prevedere che una donna risponderà tanto più efficacemente quanto più è giovane e viceversa. Alcune condizioni endocrine ( per es. la sindrome dell’ovaio micropolicistico) presentano una risposta caratteristica almeno in parte prevedibile.

Nel complesso, quando una paziente effettua il primo ciclo, le viene assegnato un protocollo di stimolazione standardizzato, scelto principalmente sulla base dell’età e di dati clinici rilevanti. In seguito sarà più semplice personalizzare l’approccio terapeutico I farmaci utilizzati per stimolare la crescita follicolare multipla sono le gonadotropine ipofisarie, cioè gli ormoni prodotti naturalmente dall’ipofisi per indurre l’ovulazione fisiologica ( in natura), ma impiegate a dosaggi tali da produrre lo sviluppo contemporaneo di più ovociti. Tali sostanze sono di origine estrattiva ( ricavati cioè da materiali biologici) e sintetiche, cioè prodotte in laboratorio Allo scopo di ottenere una crescita più omogenea dei follicoli ed evitare ovulazioni spontanee intempestive che possono compromettere l’esito dell’intervento, possono essere impiegati farmaci che permettono di evitare l’interferenza del sistema di controllo cerebrale della paziente sui meccanismi dell’ovulazione e quindi consentono di controllare completamente dall’esterno l’andamento della stimolazione. Si tratta di farmaci molto simili agli ormoni prodotti dall’ipotalamo, ma molto più potenti: sono gli ANALOGHI del GnRH, somministrabili per via intramuscolare, sottocutanea o nasale. Si possono programmare all’inizio della stimolazione o in contemporanea, ma con la stessa finalità.

La somministrazione di tali prodotti per via intramuscolare in preparazione deposito ( modalità soppressiva) ha drasticamente ridotto l’incidenza di complicanze gravi ( iperstimolazione ovarica severa), per cui si sceglie generalmente di associare tale somministrazione di routine nelle pazienti al di sotto dei 36 anni, riservando protocolli meno soppressivi nelle pazienti meno giovani e in coloro che, nonostante la giovane età, abbiano dato risposta insoddisfacente in un precedente ciclo di stimolazione con soppressione ( low responders) Durante la fase di crescita ( fase di stimolazione), vengono effettuati attenti controlli ecografici e dosaggi dell’ormone prodotto dai follicoli in fase di crescita ( ESTRADIOLO), con lo scopo di determinare il momento opportuno per il recupero degli ovociti e per evitare una stimolazione eccessiva. Nel momento in cui un numero sufficiente di follicoli raggiunge un stadio adeguato di crescita, viene indotta la fase finale di maturazione follicolare tramite la somministrazione di HCG che, come già visto, simula l’azione svolta dall’LH nei cicli naturali. Il monitoraggio della crescita follicolare è finalizzato tanto all’ottenimento ottimale di ovociti quanto a limitare l’insorgenza di condizioni potenzialmente rischiose per la salute della paziente. Sarà perciò possibile sospendere il ciclo di stimolazione qualora: -non vi sia alcun follicolo in via di sviluppo; -insorga un blocco maturativo con regressione dei follicoli;

-l’ecografia ed i parametri ormonali ( 17 beta Estradiolo) siano in discordanza tra loro, avallando il sospetto di una cattiva maturazione; -i follicoli si sviluppino solamente in un ovaio inaccessibile al prelievo; -lo stato di salute della paziente siano compromesse da malattie sopraggiunte; -lo sviluppo follicolare ed i livelli di 17 beta Estradiolo facciano ritenere altamente probabile l’insorgenza di una sindrome da iperstimolazione ovarica severa. Il prelievo degli ovociti Dopo circa 33/36 ore dalla somministrazione di HCG, si procede a recupero degli ovociti dai follicoli. Ciò avviene tramite una tecnica chirurgica semplice, nella quale gli ovociti vengono aspirati tramite un ago fatto penetrare attraverso la parete vaginale, sotto controllo ecografico ( pick up ovocitario). Alla paziente stesa su lettino in posizione ginecologica, viene praticata una anestesia locale all’interno della vagina. Dopo pochi minuti viene inserita una sonda vaginale identica a quella usata per il monitoraggio: sotto controllo ecografico si introduce un ago attraverso il fornice vaginale introdotto per pochi centimetri in addome fino a penetrare all’interno dell’ovaio, aspirando il contenuto di ogni singolo follicolo. La puntura suscita un modesto dolore ben tollerato in genere dalle pazienti, tanto che raramente è necessario ricorrere all’anestesia generale. Mano a mano che i liquidi follicolari vengono aspirati, le provette vengono portate al laboratorio dove il biologo vi ricerca gli ovociti, ne valuta le caratteristiche morfologiche, li trasferisce in incubatore, in mezzo di coltura sterile, in sostanze nutritive adatte a garantire la loro sopravvivenza. Questa fase deve essere veloce ed avvenire in ambiente adeguato per temperatura, tensione gassosa, umidità, in modo che l’ovocita, molto sensibile alla luce e alle modificazioni termiche, non subisca stress che ne possono compromettere la sopravvivenza. Terminata l’aspirazione dei follicoli, si verifica l’assenza di sanguinamenti in addome sempre per via ecografica. In genere la paziente è dimissibile dopo 2/4 ore dall’intervento. L’inseminazione in vitro Poco dopo il prelievo degli ovociti, al partner maschile viene chiesto di produrre, tramite masturbazione, un campione seminale che viene sottoposto a un procedimento ( detto “di capacitazione”) atto a selezionare gli elementi dotati di migliori caratteristiche di vitalità e morfologia. Gli spermatozoi capacitati vengono poi posti in una quantità adeguata a contatto con gli ovociti per un periodo di circa 16/18 ore, in seguito al quale viene accertato l’esito dell’inseminazione. Questa tecnica richiede un numero minimo di spermatozoi al termine della preparazione del liquido seminale ( almeno 1.500.000 spermatozoi validamente mobili e normoconformati). Al di sotto di tali valori si ritiene che le probabilità di fertilizzazione siano troppo basse e si consiglia di orientarsi direttamente a tecniche più specifiche per i casi di patologia maschile. La vigente legge ( 40/2004) prevede che “ …… non devono creare un numero di embrioni superiore a quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre”.

In adempimento a tale disposizione il numero di ovociti inseminati non potrà essere quindi superiore a tre. In genere la fecondazione avviene per il 60/70% degli ovociti; il risultato complessivo di questa fase, comunque, può variare molto da caso a caso, senza una evidente spiegazione La coltura in vitro Gli ovociti che mostrano segni di normale fecondazione ( ootide o ovocita a 2 pronuclei) vengono mantenuti in coltura, ossia in un ambiente di crescita adeguato, per ulteriori 24- 48 ore. Durante questo periodo i 2 pronuclei scompaiono formando lo zigote. Successivamente si assiste alla prima divisione cellulare, momento nel quale si è in presenza dell’embrione vero e proprio.

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